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ISSN : 1598-6721(Print)
ISSN : 2288-0771(Online)
The Korean Society of Manufacturing Process Engineers Vol.15 No.5 pp.86-92
DOI : https://doi.org/10.14775/ksmpe.2016.15.5.086

A Study on Fabrication of 3D Porous Scaffold Combined with Polymer Deposition System and a Salt Leaching Method

Hae-Ri Shim*, Min-Woo Sa*, Jong Young Kim*#
*Department of Mechanical Engineering, Andong National UNIV.
Corresponding Author : jykim@anu.ac.kr+82-54-820-5669, +82-54-820-6127
December 22, 2015 February 29, 2016 March 2, 2016

Abstract

In this study, we used a polymer deposition system, based on fused deposition modeling, to fabricate the 3D scaffold and then fabricated micro-pores on a 3D scaffold using a salt leaching method. Materials included polycaprolactone (PCL) and sodium chloride (NaCl). The 3D porous scaffolds were fabricated according to blending ratio such as PCL (70 wt%)/NaCl (30 wt%) and PCL (50 wt%)/NaCl (50 wt%). The 3D porous scaffolds were observed by scanning electron microscopy. The results showed that 3D porous scaffolds had a deposition width of 500 μm, contained a pore size of 500 μm and below 100 μm. To evaluate the 3D porous scaffolds for bone tissue engineering, we carried out the cell proliferation experiment using a CCK-8 and a mechanical strength test using a universal testing machine. In summary, the 3D porous scaffold was found to be suitable for cancellous bone of human in accordance with the result of in-vitro cell proliferation and mechanical strength. Thus, a 3D porous scaffold could be a promising approach for effective bone regeneration.


폴리머 적층 시스템과 염 침출법을 결합한 3차원 다공성 인공지지체 제작

심 해리*, 사 민우*, 김 종영*#
*국립안동대학교 기계공학과

초록


    Ministry of Education
    National Research Foundation
    NRF-2013R1A1A4A01010936

    © The Korean Society of Manufacturing Process Engineers. All rights reserved.

    This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

    1.서 론

    손상된 골 조직(bone tissue)을 재생하기 위해 3차 원 인공지지체(3D scaffold) 제작에 관한 연구가 많 이 수행되고 있다.[1,2] 우리 몸의 조직 기관 중에 하 나인 뼈(bone)는 크게 해면골(cancellous bone)과 피 질골(cortical bone)로 이루어져 있다. 해면골은 뼈 안쪽의 골수를 지지하고 조직을 제공하는 역할을 하고, 50~90%의 공극률을 가지며 그 크기는 수 mm 를 가진다. 피질골은 골 조직을 형성하고 영양분을 공급하는 혈관을 포함하고, 공극률은 30% 미만이며 공극의 직경은 1 mm 보다 작은 공극들로 이루어져 있다.[3,4] 공극 크기와 공극률에 따라 기계적 강도가 나뉘며, 해면골은 4~12 MPa, 피질골은 130~180 MPa의 강도를 가진다고 보고되고 있다.[5] 이러한 뼈의 구조로 인해 다공성 인공지지체를 제작하여 손상된 골 조직 재생을 돕는 연구가 활발히 이루어 지고 있다.[6] 이때 인공지지체는 독성이나 이물반응 이 없는 생체적합성(biocompatibility) 재료를 사용해 야 하고, 조직이 형성되어 자라면서 몸속에서 분해 되어야하기 때문에 생분해성(biodegradability)의 조 건을 만족하는 생체재료를 이용하여야 한다. 특히 골 조직 재생을 돕기 위해 이식될 인공지지체는 적 절 한 기 계적 강 도 또 한 갖 추 어 야 한 다 . [7~9]

    이러한 인공지지체 제작방법에는 염 침출법(salt leaching), 가스 발포법(gas foaming), 스폰지 복제법 (sponge replica), 그리고 동결건조법(freeze drying) 등이 있다.[10~12] 이러한 제작 방법들은 높은 공극률 과 다양한 공극크기를 갖는 인공지지체를 제작할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 공극이나 형상의 정밀한 설계가 어렵다는 단점이 있다. 또한 인공지 지체 내부에 생성된 공극들이 3차원적인 상호연결 성이 약해 세포 증식에 어려움이 따른다.[13,14]

    최근 자유 형상 제작(solid freeform fabrication, SFF)기술 기반의 3D 프린팅 기술을 적용하여 인공 지지체를 제작하는 기술이 많이 개발되는 추세이 다.[15,16] 대표적인 예로 열 용해 적층법(fused deposition modeling, FDM), 선택적 레이저 소결법 (selective laser sintering, SLS), 그리고 광 조형법 (stereolithography, SLA)등이 있다.[17~19] 이러한 인공 지지체 제작 기술들은 아래층 단면부터 순차적으로 적층함으로써 3차원 형태의 인공지지체를 보다 쉽 고 빠르게 제작할 수 있다는 장점이 있다.[18]

    본 연구에서는 골 조직 재생을 위해 다공성 인공 지지체를 제작할 수 있는 염 침출법과 그 단점을 보완하여 공극끼리의 상호연결성을 높여 줄 수 있 는 3D 프린팅 기술을 접목시켜 3차원 다공성 인공 지지체를 제작하고자 한다. FDM 기반의 폴리머 적 층 시스템(polymer deposition system, PDS)[20]을 사용 하여 규칙적인 공극 패턴을 가지는 3차원 형상을 제작하고, 그 후에 염 침출법으로 다양한 공극 크 기를 가질 수 있도록 제작한다. 이러한 다공성 구 조로 인해 주변으로부터 산소와 영양분 전달이 용 이 해질 것으로 판단된다.[21] 제작된 3차원 다공성 인공지지체의 형상을 관찰하기 위해 주사 전자 현 미경(scanning electron microscopy (SEM), Tescan VEGA II LMU, Czech)이 이용되었다. 또한, 골 조 직 재생에 적합한 지를 평가하기 위해 기계적 강도 평가와 in-vitro 세포 부착 및 증식 평가를 수행하였 다.

    2.3차원 다공성 인공지지체 제작

    2.1.폴리머 적층 시스템(PDS)

    손상된 골 조직을 대체하기 위한 3차원 다공성 인공지지체 제작을 위해 열 용해 적층법 기반으로 개발된 PDS를 사용하였다. Fig. 1과 Table 1에 PDS 의 모습과 사양을 나타내었다. 본 시스템은 X, Y, 그리고 Z축(head axis)에 정밀모션 제어 시스템이 적용되어 있으며, Z축에 디스펜서(Super ΣEX-V7, Musashi, Japan)와 서모 마스터(TCU-02, Musashi, Japan)가 연결되어 있어 압력과 온도의 제어가 가능 하다. 콤프레샤(S50-50-5.5, Airssen, Korea)에서 나온 압축된 공기를 디스펜서를 통해 최대 700 kPa까지 분사할 수 있고, 온도는 서모마스터를 사용하여 최 대 250°C까지 조절이 가능하다.

    2.2.재료

    3차원 다공성 인공지지체를 제작하기 위해 폴리 카프로락톤(polycarprolactone(PCL), Mn 43,000-50,000, polysciences, Inc., UK)과 염화나트륨(sodium chloride (NaCl), Sigma-aldrich Co., USA) 두 가지 재료를 혼 합하여 사용하였다. 합성고분자 생채재료인 PCL은 조직 공학 분야에서 가장 널리 사용되는 생체 재료 로써 생체 적합성과 생분해성을 띄고 있다.[22] 또 녹는점이 60°C로 가공이용이하다는 장점이 있다. 흰 색 파우더형태의 NaCl은염 침출법을 이용한인공지 지체 제작에 가장 널리 사용되는 재료로써 독성이 없 고 세포 증식 실험에 적합하다.[23] 인공지지체를 제작 함에 있어 적합한 필요조건을 갖춘 두 재료를 혼합하 여3차원다공성인공지지체를제작하였다.

    본연구에서 사용된노즐의내경은500 μm로서, 평 균 500 μm입자크기를 갖는 NaCl의 혼합물을 분사하 기에는 어려움이 있었다. 노즐의 막힘을 최소화하기 위해 100 μm 크기의 체(sieve)로 거른 후 제작에 임하 였다.

    2.3.제작 방법

    3차원 다공성 인공지지체의 재료 혼합 방법 및 제 작 과정을 Fig. 2에 나타내었다. 우선 pellet 형태의 PCL과 체에 걸러진 NaCl을 100°C의 hot plate위에서 혼합한 후, syringe에 넣어 PDS을 이용하여 3차원 형 상의 인공지지체를 제작하였다. 이때 X, Y축의 이송 속도는 평균 200 mm/min, Z축의 재료분사 압력은 평 균500 kPa를주어제작하였다.

    PDS에 의해 제작된 인공지지체를 45°C의 증류수 가 들어있는 초음파 세척기에 3시간 동안 염 침출법 공정을 수행한 후, 24 시간 동안 30°C의 오븐(OF-12, JEIO Tech., Korea)에서 건조 시켰다(Table 2). 재료혼 합비율에있어서NaCl 의함유량이30 wt%보다적으 면 다공성 구조로 제작이 어렵고, 50 wt%보다 많을 경우 재료의 분사가 잘 이루어지지 않아 적층하는데 어려움이 있다. 재료 혼합비율은 PCL(70 wt%)/NaCl (30 wt%)과 PCL(50 wt%)/NaCl(50 wt%)로 설정하여 인공지지체를 제작하였다. 또한 다공성 구조의 효과 를 관찰하기 위해 PCL로만 제작된 인공지지체와 비 교하였다.

    3.3차원 다공성 인공지지체 평가

    3.1.주사 전자 현미경 관찰

    제작된 3차원다공성 인공지지체의 형상과공극의 형태를 관찰하기 위해 주사 전자 현미경을 이용하였 다. 폴리머 재료인 인공지지체를 50 s동안 Au코팅 후 에 20 kV의 가속 전압을 주어 관찰하였다. Fig. 3은 PCL, PCL(70 wt%)/NaCl(30 wt%) 그리고 PCL(50 wt%)/NaCl(50 wt%) 인공지지체의 SEM 사진을 보여 주고 있다. 3차원 형상으로 잘 제작된 것을 확인할 수 있었고, 그 선폭을 확대하여 관찰해보면 염 침출법에 의해 작은 공극들이 생성된 것을 관찰할 수 있었다. 또, 인공지지체의단면을잘라관찰했을때공극이생 성된 것을 확인할 수 있었다.

    제작된 3차원다공성 인공지지체의 공극률을 계산 하여 비교해보았다.[25] 그계산식은Eq. 1에 나타내었 다. V0는 3차원 형상의 인공지지체 부피를, ρ는 PCL 의 밀도를, m은 NaCl이 제거된 인공지지체의 무게를 나타낸다.

    Porosity = V o m ρ V o × 100 %
    (1)

    PCL 인공지지체의 공극률은 약 36.9%, PCL(70 wt%)/NaCl(30 wt%)인공지지체는 약 66.9 %, PCL(50 wt%)/NaCl(50 wt%) 인공지지체는 약 82.9 %의 공극 률로 계산을 통해 얻을 수 있었다. 인공지지체 내에 NaCl의 함유량이 많을수록 공극률이 높게 나타났다. NaCl이 무게비율로 혼합되어 있기 때문에 인공지지 체 내에 포함되어 있는 NaCl이 많이 빠져 나가면서 높은 공극률을 나타낸 것으로 판단된다.

    3.2.기계적 강도 평가

    본 연구에서 제작된 3차원 다공성 인공지지체가 골과 유사한 강도를 지니는지 확인하기 위해 기계적 강도 평가를 실시하였다.

    각각의 비율로 혼합된 인공지지체를 각각 3개씩 준비하여 압축 시험기(JSV H1000, JISC, Japan)로 하 중속도를1 mm/min을 주어 실험을수행하였다. 얻어 진 값으로평균값을 계산하여 응력-변형률곡선을 그 린 후 압축 강도와 압축 탄성계수를 계산하였다(Fig. 4). PCL 인공지지체의 기계적 강도가 7.2 MPa로 우수 하게 나타났고, 그 다음으로 PCL(70 wt%)/NaCl(30 wt%)인공지지체가 4.8 MPa, PCL(50 wt%)/NaCl(50 wt%)인공지지체가 4.3 MPa로 나타났다(Table 3). 제 작된 인공지지체는 NaCl의 함유량이 많을수록 강도 가낮아지는것을확인할수있었다. 인공지지체내에 NaCl이 염 침출법 공정으로 제거되어 다공성 구조로 형성되면서 강도가 약해졌다. 하지만 모든 인공지지 체의 강도는 인체의 해면골의 강도와 유사하게 나타 나고 있어 손상된 골 조직의 대체품으로써 적합하다 고 판단된다.[25]

    3.3.세포 증식 평가 결과

    손상된 골 조직에 효과적인지 평가하기 위하여 human osteosarcoma(MG-63) cell을 이용하였다. 제작 된 3차원 다공성 인공지지체는 70 %의 에탄올에 넣 어 클린벤치에서 자외선 소독하였고, PBS(phosphate buffered saline, HyClone®, Thermo scientific, USA)를 이용하여 세척하였다. 세포 배양액으로는 450 ml DMEM(D-minimum essential medium/high glucose, HyClone, Logan, UT, USA)에 50 ml FBS(fetal bovine serum, Gibco, Rockville, MD, USA) 그리고 5 ml 페니 실린(penicillin streptomycin, Sigma, St. Louis, USA)을 혼합하여 사용하였다.[24] 배양된 세포를 세척이 끝난 인공지지체에 1×105 cells씩 골고루 파종한 후 1, 3, 5 그리고7일동안세포증식을관찰하였다. CCK-8(cell counting kit-8, Dojindo, Japan)용액과 세포 배양액을 1:10의 비율로 혼합하여 배양액 대신 세포가 파종되 어 있는 인공지지체에 넣어 4시간 동안 인큐베이터 에서 배양하였다. 그 후 Microreader (UVM340, Elisa, USA)를 이용하여 450 nm 에서 흡광도를 Fig. 5에 표 기하였다. 1일 차에서 O.D(optical density) 값은 PCL 인공지지체보다 거의 유사하거나 조금 더 높은 값을 보였다. 기존의 유사한 연구 결과와 같이[21,25] 제작된 인공지지체가 다공성 구조를 형성하면서 세포의 부 착율을크게증가시킬것으로예상했지만, 본연구에 서는 큰 차이를 나타내지는 않았다. 하지만 5일차, 7 일차로 진행될수록 3차원 다공성 인공지지체들의 O.D값이 높게 나타났다. 이러한 결과는 PCL 인공지 지체보다 더 높은 공극률을 가지게 되면서 주변으로 부터 산소와 영양분의 공급이 원활하게 이루어진 것 으로 판단된다.

    4.결 론

    본 연구에서는 손상된 골 조직을 재생하기 위하 여 열 용해 적층법 기반의 PDS와 염 침출법을 결 합하여 3차원 다공성 인공지지체를 제작하였고 다 음과 같은 결론을 얻었다.

    1. 제작된 3차원 다공성 인공지지체는 SEM 분석 결 과 PDS에 의해 상호연결성이 좋은 공극을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 염 침출법에 의해 그 선 폭 위에 크고 작은 공극들이 생겨 다공성 구조를 이루는 것을 관찰할 수 있었다.

    2. 골 조직을 대체하기에 적합한지 확인하기 위해 기 계적 강도 평가와 세포 증식 평가를 수행하였다. 그 결과 제작된 인공지지체는 인체의 해면골의 강도인4~12 MPa에포함되는 강도를가지는것을 확인할 수 있었다. 또, 세포 증식 평가를 통해 다 공성 구조를 갖는 인공지지체가 세포 증식에 더 좋은 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다.

    향후 3차원 다공성 인공지지체의 제작 공정을 보 완하여 더 많은 공극을 갖는 인공지지체를 제작하 는 연구를 수행할 계획이다. 기계적 특성은 지금의 강도를 유지하는 선에서 세포 부착율을 높일 수 있 는 방안으로 인공지지체를 제작하여 기존의 방법으 로 제작된 인공지지체와 비교하는 연구를 수행하고 자 한다.

    후 기

    “이 논문은 2013년도 교육부의 재원으로 한국연구 재단의 기초연구사업지원에 의하여 연구되었음.” (NRF-2013R1A1A4A01010936)

    Figure

    KSMPE-15-5-86_F1.gif

    The actual image of PDS

    KSMPE-15-5-86_F2.gif

    A fabrication process of 3D porous scaffold

    KSMPE-15-5-86_F3.gif

    The SEM images of 3D porous scaffold(left: top view, middle: line width, right: a cross section)

    KSMPE-15-5-86_F4.gif

    Stress-strain curves for the comparison of 3D porous scaffolds

    KSMPE-15-5-86_F5.gif

    The cell proliferation result of 3D porous scaffolds

    Table

    Specification of PDS[20]

    The process condition of 3D porous scaffold by PDS and salt leaching

    Mechanical strength of 3D porous scaffolds

    Reference

    1. Ohgushi H , Goldberg V M , Caplan A I (1989) “Heterotopic Osteogenesis in Porous Ceramics Induced by Marrow Cells” , Journal of Orthopaedic Research, Vol.7 (4) ; pp.568-578
    2. Cancedda R , Dozin B , Giannoni P , Quarto R (2003) “Tissue Engineering and Cell Therapy of Cartilage and Bone” , Matrix Biology, Vol.22 (1) ; pp.81-91
    3. Bao C L M , Teo E Y , Chong M S , Liu Y , Choolani M , Chan J K (2013) “Advances in Bone Tissue Engineering” , Regenerative Medicine nd Tissue Engineering, ; pp.599-614
    4. Karageorgiou V , Kaplan D (2005) “Porosity of D Biomaterial Scaffolds and Osteogenesis” , Biomaterials, Vol.26 (27) ; pp.5474-5491
    5. Whang K , Healy K E , Elenz D R , Nam E , Tsai D C , Thomas C H , Nuber G W , Glorieux F H , Travers R , Sprague S M (1999) “Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture” , Tissue engineering, Vol.5 (1) ; pp.35-51
    6. Jamalpoor Z , Mirzadeh H , Joghataei M T , Zeini D , Bagheri-Khoulenjani S , Nourani M R (2015) “Fabrication of Cancellous Biomimetic Chitosan-based Nanocomposite Scaffolds Applyinga Combinational Method for Bone Tissue Engineering” , Journal of Biomedical Materials Research Part A, Vol.103 (5) ; pp.1882-1892
    7. Sheridan M H , Shea L D , Peters M C , Mooney D J (2000) “Bioabsorbable Polymer Scaffolds for Tissue Engineering Capable of Sustained Growth Factor Delivery” , Journal of Controlled Release, Vol.64 (1-3) ; pp.91-102
    8. Yang S , Leong K F , Du A , Chua C K (2001) “The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering” , Part I. Traditional Factors. Tissue engineering, Vol.7 (6) ; pp.679-689
    9. Vats A , Tolley N S , Polak J M , Gough J E (2003) “Scaffolds and Biomaterials for Tissue Engineering: a Review of Clinical Applications” , Clinical Otolaryngology & Allied Sciences, Vol.28 (3) ; pp.165-172
    10. Lee S B , Kim Y H , Chong M S , Hong H , Lee Y M (2005) “Study of Gelatin-containing Artificial Skin V: Fabrication of Gelatin Scaffolds using a Salt-leaching Method” , Biomaterials, Vol.26 (14) ; pp.1961-1968
    11. Kim H J , Park I K , Kim J H , Cho C S , Kim M S (2012) “Gas Foaming Fabrication of Porous Biphasic Calcium Phosphate for Bone Regeneration” , Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Vol.9 (2) ; pp.63-68
    12. Ho M H , Kuo P Y , Hsieh H J , Hsien TY , Hou L T , Lai J Y , Wang D M (2004) “Preparation of Porous Scaffolds by using Freeze-extraction and Freeze-gelation Methods” , Biomaterials, Vol.25 (1) ; pp.129-138
    13. Mikos A G , Temenoff J S (2000) “Formationof Highly Porous Biodegradable Scaffolds for Tissue Engineering” , Electronic Journal of Biotechnology, Vol.3 (2) ; pp.23-24
    14. Park S A , Lee J H , Kim W D (2009) “Development of Biomimetic Scaffold for Tissue Engineering” , Elastomers and Composites, Vol.44 (2) ; pp.106-111
    15. Jeong H J , Jee M H , Kim S Y , Lee S J (2014) “Measurement of the Compressive Force on the Knee Joint Model fabricated by 3D Printing” , Journal of the Korean Society of ManufacturingProcess Engineers, Vol.13 (2) ; pp.1-7
    16. Park J H , Jang J , Cho D W (2014) “Three-Dimensional Printed 3D Structure for Tissue Engineering” , Trans. Korean Soc. Mech. Eng. B, Vol.38 (10) ; pp.817-829
    17. Pati F , Song T H , Rijal G , Jang J , Kim S W , Cho D W (2015) “Ornamenting 3D Printed Scaffolds with Cell-laid Extracellular Matrix for Bone Tissue Regeneration” , Biomaterials, Vol.37 ; pp.230-241
    18. Lee J W , Kim J Y , Cho D W (2010) “Solid Free-form Fabrication Technology and Its Application to Bone Tissue Engineering” , International Journal of Stem Cells, Vol.3 (2) ; pp.85-95
    19. Sa M W , Kim J Y (2013) “Design of Multi-scaffold Fabrication System for Various 3D Scaffolds” , Journal of Mechanical Science and Technology, Vol.27 (10) ; pp.2961-2966
    20. Sa M W , Kim J Y (2013) “Effect of VariousBlending Ratios on the Cell Characteristics of PCL and PLGA Scaffolds Fabricated by Polymer Deposition System” , International Journal of Precision Engineering and Manufacturing, Vol.14 (4) ; pp.649-655
    21. Jeon H A , Lee S W , Kwon O H (2014) “Fabrication of Poly(γ-glutamic acid) Porous Scaffold for Tissue Engineering Applications” , Journal of the Korean Society of Manufacturing Process Engineers, Vol.13 (3) ; pp.35-41
    22. Martina M , Hutmacher D W (2007) Biodegradable Polymers Applied in Tissue Engineering Research: a review” , Polymer International, Vol.56 (2) ; pp.145-157
    23. Hou Q , Grijpma D W , Feijen J (2003) “PorousPolymeric Structures for Tissue Engineering Prepared by a Coagulation, Compression Moulding and Salt Leaching Technique” , Biomaterials, Vol.24 (11) ; pp.1937-1947
    24. Shim J H , Lee J S , Kim J Y (2012) “Fabrication of Solid Freeform Fabrication based 3D Scaffold and Its In-vitro Characteristic Evaluation for Bone Tissue Engineering” , Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Vol.9 (1) ; pp.16-23
    25. Cho Y S , Hong M W , Kim Y Y , Cho Y S (2014) “Assessment of Cell Proliferation in Salt-leaching using Powder(SLUP) Scaffolds with Penetrated Macro-pores” , Journal of Applied Polymer Science, Vol.131 ; pp.9